La película comienza contando la infancia de Leónidas I y de su entrenamiento para ser el próximo rey. Porque,- como todo espartano-, como esclavo o como rey, debía cumplir la ley.
Un día, siendo ya rey de Esparta, llega a visitarlo un emisario persa de Jerjes I. Éste le comunica la exigencia de pagar un tributo de tierra y agua a cambio de no arrasar Esparta. Leónidas se niega y tira a un pozo al emisario y a sus escoltas. Después de esto, decidido a plantarle cara al ejército persa, visita al oráculo, ya que ningún rey espartano podía ir a la guerra sin hacerlo. El oráculo le prohibió que fuese; sin embargo, Leónidas, no hizo caso.
Ante la inminente batalla, con la decisión de luchar en las Termópilas ya tomada, mandó a su capitán a que reuniera un ejército de 300 guerreros que tuviesen descendencia. Así intentó justificar su marcha a la batalla, pues al ir solo con trescientos hombres, era verdad que no estaba enviando al ejército espartano a la guerra, con lo cual ---en apariencia--- no incumplía la prohibición del oráculo. De camino a las Termópilas, se encontró con guerreros de otras polis griegas y se unió a ellos.
Una vez llegados al lugar de la batalla, recibieron a un segundo emisario persa, el cual corrió (segura y finalmente) la misma suerte que el anterior diplomático. Ante esto, Jerjes, comienza a enviar ráfagas de tropas que van cayendo sucesivamente ante los trescientos guerreros espartanos debido a la estrategia de los espartanos de luchar en el desfiladero de las Termópilas, cuya anchura no superaba los veinte metros en algunas partes y de esta manera se igualaban las fuerzas de ambos mandos.
Jerjes, desesperado por los fracasos sucesivos de sus tropas, envía a sus mejores soldados, los Inmortales, que son igualmente derrotados. En ese momento, un hombre exiliado y rechazado por el ejército espartano por considerarle incapacitado para la lucha, visita a Leónidas para ofrecerle sus servicios. Tras su rechazo visita a Jerjes, y a cambio de un uniforme, riqueza, lujos y mujeres, le cuenta el secreto para derrotar a los trescientos espartanos, pues le descubre un camino ---la senda Anopea--- que lo llevará hasta la retaguardia de la posición de Leónidas en las Termópilas. Los arcadios, al enterarse, se retiran por considerar indefendible la posición y abandonan a Leónidas. Éste se limita a enviar a un guerrero como emisario a Esparta para avisar a su pueblo, pues ya sabe que el final es inminente. Una vez rodeado por las tropas de Jerjes, caen los trescientos hombres con honor en el campo de batalla aniquilada por una lluvia de flechas.
Con Leónidas muerto y superado ese obstáculo, Jerjes avanza hacia las polis. Pero, para su sorpresa y a pesar de contar aún con 90.000 hombres, se encuentra con un ejército de 30.000 soldados esperándolo.

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